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Jurkat,Clone E6-1細胞☆然泰☆人T**細胞白血病細胞細胞培養(yǎng)過程：復蘇、換液、傳代、凍存 1、復蘇 （1）取適量培養(yǎng)液加入離心管中； （2）將凍存的細胞在37℃水浴中快速使其融化； （3）將細胞吸入離心管中，1000r.min-1離心5 min,倒去上清液，規(guī)定加入培養(yǎng)液，打勻，轉移到培養(yǎng)瓶中，即可。 2、換液 （1）將培養(yǎng)瓶中已變色的培養(yǎng)液倒掉，余液用棉花蘸掉； （2）用PBS洗滌培養(yǎng)瓶（從**細胞的一側倒掉） （3）加入新鮮培養(yǎng)液，即可。 3、傳代（細胞生長得較滿、較好，分瓶后至少培養(yǎng)兩天后再鋪板） （1）將培養(yǎng)瓶中已變色的培養(yǎng)液倒掉； （2）用PBS洗滌培養(yǎng)瓶（細胞一側）； （3）加入2 mL胰酶，靜置，待細胞將脫落時，倒掉胰酶，加入培養(yǎng)液，打勻后，分至多個瓶中。 4、凍存 （1）將培養(yǎng)瓶中已變色的培養(yǎng)液倒掉； （2）用PBS洗滌培養(yǎng)瓶（細胞一側）； （3）加入胰酶，靜置，待細胞將脫落時，倒掉胰酶（可不倒），加入適量培養(yǎng)液，將貼壁細胞吹落，吸入到離心管中，1000r.min-1×5min,倒掉上清液，加入900uL新生牛血清（營養(yǎng)來源）和100 uLDMSO（保護劑）打勻后，吸到凍存管中，密封，于-80℃凍存。 1.預先配制凍存液：10 % DMSO + 90%胎牛血清，4℃冰箱保存預冷； 2.用胰酶對細胞進行消化：倒去培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基或用槍小心吸去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，PBS沖洗兩次，用胰酶消化細胞（盡可能溫和）； 3.再次用完培養(yǎng)液懸浮細胞，將預冷的凍存液加入消化完的細胞中，用滴管輕輕吹打混勻。 4.在每支凍存管中加入1ml細胞液， 密封后標記凍存細胞名稱和凍存日期。 5.凍存步驟的細致直接關系到細胞復蘇時的活力，如果有程序降溫器（放在-80℃冰箱過夜，放入液氮罐）；或者可以在4℃，2h；然后轉到-20℃，2h；-80℃，2h；放入液氮罐。 細胞復蘇 1. 從液氮容器中取出凍存管，直接浸入37℃溫水中，并不時搖動令其盡快融化。 2. 從37℃水浴中取出凍存管，打開蓋子，用吸管吸出細胞懸液，加到離心管并滴加10倍以上培養(yǎng)液，混勻； 3. 離心， 1000rpm，5min； 4. 棄去上清液，加入含10%小牛血清培養(yǎng)液重懸細胞，計數(shù)，調(diào)整細胞密度，接種培養(yǎng)瓶，37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)； 5. 次日*換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。 鋪板（逐個鋪板，減少污染，鋪板時濃度由低到高） （1）將培養(yǎng)瓶中已變色的培養(yǎng)液倒掉； （2）用PBS洗滌培養(yǎng)瓶（細胞一側）； （3）加胰酶2 mL，細胞將脫落時倒掉胰酶，加培養(yǎng)基少許，打勻（吹開），1000r.min-1×3min,倒掉上清液，加入培養(yǎng)液（一般10mL,根據(jù)細胞數(shù)和鋪板數(shù)量），打勻（可用刻度吸管打勻，注意棉花塞）；（4）取100uL/每孔，加入到96孔板上（5000-8000個/孔）。 鋪板注：（1）邊緣孔一般不加細胞，僅加PBS，為*止“邊緣效應”引起的數(shù)據(jù)不合理， （2）加藥和的均需加Cell（原料藥SPD，先用少量DMSO溶解，再加細胞 培養(yǎng)液稀釋到所需體積，即只加培養(yǎng)液）。 96孔板12×8，周邊填滿，中間為60。 計數(shù)： 計數(shù)板先用水洗后，再用75%乙醇洗，待其干后再用。 用取液槍取適量溶液加入到計數(shù)板上，顯微鏡下觀察計數(shù)（個數(shù)×104/mL） 流式細胞儀流程： 1、基本操作： （1）、收集細胞：胰酶消化各孔（6孔板），收集到離心管，離心得沉淀； （2）、用PBS打勻，洗1-2遍，離心，沉淀； （3）、沉淀的細胞中加入500uL緩沖液，得懸液； （4）、加5uL AnnexinV-FITC（細胞凋亡檢測試劑盒）,混勻； （5）、5uLPI混勻； (4)-(6)三組需要避光操作！ （6）、流式細胞儀測定。（4×105/孔，6孔板，2mL/孔） 若**天流式測量，可加5—10mL70%乙醇，在4℃固定8h以上。 2、制備細胞凋亡單染管： （1）、活細胞 （2）、一半活細胞+一半死細胞（高溫滅活-水浴90℃）+FITC（染色活Cell） （3）、一半活細胞+一半死細胞+PI（PI-碘化丙啶染色核酸，但不能穿透細胞膜即染色死Cell） （4）、一半活細胞+一半死細胞+FITC（堿性環(huán)境與抗體蛋白反應，主要是與賴氨酸的氨基與熒光素的硫碳胺鍵結合，形成FITC-蛋白質(zhì)結合）+PI PBS的配制：(1000mL) NaCl 8.0 g 、KCl 0.2 g、 KH2PO4 0.2 g 、Na2HPO4.12H2O 2.9 g 加超*水至1000mL高壓蒸汽**，4℃儲存，備用。 細胞器具清洗： 瓶、管等+潔消精（過夜12 h），自來水沖洗25遍，蒸餾水沖1-2遍，蒸餾水泡過夜12 h,烘干，高壓蒸汽**（約2 h）,再烘干，至少2-3天，方可用。 MTT溶液的配制： MTT濃度為5 mg/mL，溶于PBS或*酚紅的培養(yǎng)基中，用0.22 um濾膜過濾以除去溶液里的**，放4℃避光保存即可。 注：（1）在酶標儀檢測結果時，為實驗結果的線性，MTT吸光度在0-0.7范圍； （2）MTT一般現(xiàn)用現(xiàn)配，過濾后4℃，避光保存2周**，或保存在-20℃長期保存；避免**凍融，小劑量分裝，用避光袋、錫箔紙包裹；一般把MTT粉分裝在EP管，再現(xiàn)用現(xiàn)配，當MTT變?yōu)榛?*時*不能再用； （3）MTT致癌，用時帶透明薄膜手套。

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